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Preparazione dei campioni

Introduzione del Fluorocromo nelle cellule e nei tessuti.

Alcuni fluorocromi come DAPI (un colorante per DNA) generalmente non sono trasportati attraverso la membrana plasmatica. Così, l'introduzione di un colorante o dye loading, può rappresentare un problema . Spesso l'aggiunta di un detergente (saponina, Tween - 20, DMSO, ecc) può essere utilizzato per facilitare l'introduzione del fluorocromo nelle cellule viventi. Coloranti a base di cromatina possono essere introdotti e i tessuti stabilizzati da un pretrattamento del 30-50% di EtOH o congelate in ghiaccio secco (buono per i batteri). Questo trattamento, tuttavia, uccide le cellule. Per il tessuto vegetale, se si utilizza DAPI come fluorocromo, il pretrattamento con EtOH è quasi sempre necessario.L’ aggiunta di una parte carica di un fluoroforo (parte fluorescente della molecola) rende spesso il fluorocromo permeabile. Per esempio l’aggiunta di un acetato di fluoresceina (FDA), o di un gruppo di estere metilico su un qualsiasi fluorocromo può rendere il colorante compatibile con le cellule vive. Le esterasi endogene all’interno della cellula separano i gruppi di estere acetossimetilico (AM) lasciando un colorante non-permeabile ma fluorescente. Questi tipi di coloranti sono buoni indicatori della vitalità cellulare.

Sommario:

• Un trattamento detergente può facilitare l'introduzione dei fluorocromi.
• Etanolo (30-50 %) può rendere le cellule permeabili e facilitare l'ingresso del colorante.
• Un trattamento sottovuoto leggero può essere usato per rimuovere sacche d'aria e facilitare l’introduzione del colorante.
• Abrasione delicata della superficie.
• Ablazione e l’utilizzo di campioni molto piccoli, aumentando così la superficie a volume.

Montaggio del preparato.

Uno dei principali problemi nell'uso e nell'esame di campioni microscopici fluorescenti è la tendenza dei fluorofori a perdere fluorescenza o decadere quando sono eccitati da una sorgente luminosa . I radicali liberi generati durante l'eccitazione dal fluorocromo sono responsabili di questo problema . Diversi agenti chimici sono stati utilizzati per contrastare i radicali liberi e preservare la luminosità dei campioni. Il pH del mezzo di montaggio finale può anche fare una grande differenza nel tasso di che si verificherà. Di seguito è indicata una sequenza di steps da seguire per la corretta preparazione dei campioni.

• Dopo il risciacquo finale del campione in PBS il campione viene immerso in acqua distillata o deionizzata per eliminare i sali in eccesso.
• Tutto il liquido in eccesso viene rimossa dal campione con carta da filtro per azione capillare. Non lasciare che il campione essicchi!
• Una piccola goccia del mezzo di montaggio (di solito una miscela PBS/Glicerina con l'aggiunta di un agente antiquenching, sono diversi quelli commerciali disponibili) è posta sul campione. Un vetrino coprioggetto viene accuratamente posto sulla goccia del mezzo di montaggio in modo tale da evitare la formazione di bolle.
• Piccoli pezzi di carta da filtro sono posizionati intorno al bordo del vetrino per assorbire il mezzo di montaggio in eccesso. Questa operazione ha due vantaggi:

a) permette al vetrino coprioggetto di aderire meglio al preparato riducendo la profondità di campo ed ottenendo una minore aberrazione).
b) il coprioggetto avrà meno possibilità di muoversi sul vetrino portaoggetti e quindi evitare spostamenti che potrebbero provocare
danni al preparato. La tensione superficiale tra il vetrino coprioggetto e il portaoggetti sarà molto più alta, ciò permetterà di
sigillare il la slide più facilmente.

• Sigillare il bordo del vetrino con smalto trasparente e lasciare asciugare. Se il punto 4 è stato eseguito correttamente, lo smalto si asciugherà molto più velocemente e non si mescolerà con il mezzo di montaggio.Se si utilizza olio a immersione, i due passaggi precedenti saranno utili per i seguenti motivi :

a) se il mezzo di montaggio è in eccesso l'olio può mescolarsi con esso e causare quenching. Togliendo il mezzo in eccesso
e sigillando il coprioggetto si evita la comparsa di questo problema.
b) L' olio a immersione ha una elevata tensione superficiale, se il campione non è correttamente montato e sigillato, l'olio
potrebbe contribuire al movimento del coproggetto durante la messa a fuoco causando lo spostamento e l'eventuale
distruzione del campione.

E ' imperativo pulire attentamente il vetrino portaoggetti prima di osservare il campione al microscopio a fluorescenza.


Mezzo di montaggio.

Il mezzo di montaggio può essere preparato in laboratorio o acquistato tra quelli disponibili in commercio presso alcune delle aziende che si occupano di fluorocromi. Il mezzo di montaggio può essere preparato con 9 parti di glicerolo e 1 parte di PBS. Il pH deve essere regolato tra 8,5 e 9,0. Questo pH è ottimale nel prevenire il decadimento di Fluoresceina e Rhodamina. PH sopra e sotto questo range contribuiranno ad una perdita di fluorescenza molto più rapida. Una piccola quantità di un agente può essere aggiunto al mezzo di montaggio come ulteriore precauzione.

Alcuni di questi sono :

• p -fenilendiammina2
• gallato di propile3
• 1,4- diazabiciclo ( 2,2,2 ) - ottani ( DABCO )
• L'acido ascorbico (vitamina C)
• Mowiol o Gelvato